光学显微镜的空间分辨率是经过光学系统后能区分物上两点之间的最小距离。

这个距离在空间上依据所处平面的不同通常分为横向分辨率(lateral resolution)及轴向分辨率(axial resolution)，横向分辨率指物面上可分辨的最小距离，轴向分辨率则指在垂直物面方向上可分辨的最小距离。以物面上理想点光源对应像面的艾里斑为例，如果两个物点彼此远离，很容易将它们分辨为单独的对象。随着两个物点对应像面上艾里斑之间的距离逐渐减小，艾里斑逐渐重叠，当一个艾里斑的中央主极大值与另一艾里斑的第一极小值重叠时，认为是可分辨两个艾里斑的最小距离，这个极限被称为瑞利判据(Rayleigh Criterion)，如图1所示。

 瑞利判据图示

德彩网可分别得出对应的横向分辨率计算公式：

其中，λ 代表成像光的波长，NA为使用的物镜的数值孔径。

德彩网分辨率大小的评判较为主观，常用的分辨率大小计算判据除了经典的瑞利判据以外，还有两种常见判据：阿贝(Abbe)判据和斯派罗(Sparrow)判据。

其中阿贝判据对应的分辨率定义为：

横向分辨率：

轴向分辨率：

斯派罗判据对应的分辨率定义如下：

德彩网在光学显微系统中影响空间分辨率的主要因素是物镜的数值孔径，但是分辨率还取决于样本种类，照明的相干性，像差校正的程度以及其他因素。